線粒體提取試劑盒 P0940
北京諾博萊德科技有限公司常年供應(yīng)“線粒體提取試劑盒"
線粒體提取試劑盒使用說(shuō)明
一，試劑盒組份
組份 | P0940 （50T） | P0940 （100T） |
Lysis Buffer | 50 mL | 100 mL |
Mito-Wash Buffer | 25 mL | 50 mL |
Store Buffer | 5 mL | 10 mL |
二，說(shuō)明
線粒體提取試劑盒用于從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的線粒體。適合于動(dòng)物軟組織（肝或腦組織）和硬組織（肌肉）以及培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。
三，操作步驟
1. 樣本處理
a. 組織勻漿：稱取100~200 mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等，PBS或生理鹽水沖洗，洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨組織20次；
b. 培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：消化細(xì)胞，PBS洗滌，800 × g 5~10 min離心收集細(xì)胞。計(jì)數(shù)。每次提取需要5 × 107個(gè)細(xì)胞，加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi)，0℃冰浴研磨30~40次；
2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，1000× g 離心5 min；
3. 取上清，加入一新的離心管中，4℃，1000× g 再次離心5 min。
4．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 12,000 × g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底；
5. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃，1000× g 離心5 min；
6．取上清，加入一新的離心管中，4℃， 12,000 × g 離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；
6. 用50 -100μL Store Buffer 或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，立即使用或-70℃保存。
四注意事項(xiàng)：
1. 為保證獲得完整的線粒體，*是全程低溫操作。第二是快速。第三，在不破壞亞細(xì)胞器的情況下破碎細(xì)胞是制備線粒體的zui關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時(shí)較難破壁，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞。
2. 以離心力g計(jì)算正確的離心速度，不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。
3. 進(jìn)行Western Blot和2D-膠電泳，可直接加入上樣緩沖液裂解線粒體。
五儲(chǔ)存：四周內(nèi)使用可4℃儲(chǔ)存，長(zhǎng)期置-20℃
轉(zhuǎn)速與離心力換算
G＝1.11×（10-5）×R×[rpm]２
G為離心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍數(shù)來(lái)表示；
[rpm]２即：轉(zhuǎn)速的平方； R為半徑，單位為厘米。
